Новости

1. Количественная ПЦР в реальном времени

В 1996 году количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (QPCR в реальном времени) была впервые представлена компанией Applied Biosystems в Соединенных Штатах. Так называемая qPCR в реальном времени относится к добавке флуоресцентных групп к реакции ПЦР для непрерывного мониторинга флуоресцентного сигнала. Порядок появления и изменение силы сигнала можно использовать для анализа исходного количества гена-мишени в реальном времени. Изобретение этой технологии реализует скачок от качественной ПЦР к количественной.

2. Химические вещества, используемые при флуоресценции ПЦР

В настоящее время qPCR в реальном времени делится на две категории: флуоресцентные красители и флуоресцентные зонды в соответствии с различными используемыми флуоресцентными химическими веществами.

3. Красители, используемые при флуоресценции ПЦР.

Флуоресцентные красители также называются ДНК-связывающими красителями. Основной молекулой красителя, используемой в настоящее время, является SYBR Green I. SYBR Green I может специфически связываться с малой бороздкой двухцепочечной ДНК. Свободный SYBR Green I почти не имеет флуоресцентного сигнала, но связывается с двухцепочечной ДНК. После этого его флуоресцентный сигнал может быть увеличен в сотни раз. С увеличением ПЦР-продукта количество связывания ПЦР-продукта и красителя также увеличивается, и интенсивность флуоресцентного сигнала представляет собой количество двухцепочечных молекул ДНК.

Преимущества флуоресцентных красителей заключаются в том, что они просты в использовании, могут сочетаться с любым продуктом ПЦР и стоят недорого.

В целом, метод SYBR Green I является одним из самых основных и часто используемых экспериментов QPCR в реальном времени.

4. Зонды для флуоресценции ПЦР

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

При нормальных обстоятельствах пространственное расстояние между двумя группами очень близко, и флуоресцентный ген не может флуоресцировать из-за закалки. Во время ПЦР-амплификации праймер и зонд связываются с матрицей одновременно, и положение связывания зонда расположено между праймерами, расположенными выше и ниже по потоку.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

Технология зонда TaqMan решает проблему сочетания флуоресцентных красителей и неспецифического усиления. После реакции, никакая потребность для плавя обнаружения кривой, которая сокращает время теста.

Преимуществами технологии зондов TaqMan являются низкий фон флуоресценции, высокая чувствительность, высокая стабильность гибридизации, хорошее спектральное разрешение флуоресценции и высокая специфичность.

Благодаря высокой специфичности зондов TaqMan, его можно использовать для аллельного различения, особенно для полиморфизмов генов человека, а также для различения и количественной оценки штаммов на основе SNP.